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第五届·中国特色植物资源类化妆品研发、备案关键技术与案例分析系列直播研修班
5月7、14、21、28日系列直播
联系人：邢军超
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经典名方芍药甘草汤物质基准制备工艺及质量研究
刘晓美孙志强王翔王权左成彬牛保力李翔宇
山东禹泽药康产业技术研究院有限公司安徽济人药业有限公司中药提取安徽省技术创新中心
摘要：目的：采用传统工艺与现代分析技术相结合的方法研究芍药甘草汤的制备工艺及质量标准。方法：遵循传统煎煮方法，以芍药甘草汤的有效成分芍药苷、甘草苷、甘草酸对煎煮过程中的参数进行考察，包括粉碎粒度、煎器、加热方式、浸泡时间、是否加盖等。考察不同浓缩温度、干燥方式对有效成分的保留率并确定最佳工艺。结果：确定芍药甘草汤物质基准的制备工艺，芍药、炒甘草粉碎过4目筛，按比例称取置于2L砂锅中，加水mL，盖盖，浸泡30min，于电陶炉上加热，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（过目筛），滤液减压浓缩（50℃，-0.1MPa）至50mL，预冻至结冰，冷冻干燥，研细，装袋，即得。通过质量标准研究确定各指标成分的含量限度：芍药苷含量限度为28.4～52.6mg/g，甘草苷含量限度为7.7～14.1mg/g，甘草酸含量限度为20.6～38.2mg/g；建立了15批芍药甘草汤冻干粉的特征图谱并确定了9个共有峰，其中3、5、9号峰为芍药苷、甘草苷、甘草酸。结论：芍药甘草汤物质基准的制备工艺，稳定可行，为芍药甘草汤质量标准研究提供了理论基础。芍药甘草汤始载于东汉医家张仲景所著《伤寒论》，由芍药、甘草两味药组成，临床应用历史悠久，安全性高，疗效确切。该方配伍精简，具有和营散逆、舒挛止痛的功效[1]。经典名方对药材来源、饮片炮制、配伍比例、制备工艺等进行了严格要求。由于经典名方配方多样，且成分复杂，建立经典名方的质量标准，将经典名方中有效成分量化，更有利保证传统古方的质量及疗效[2,3,4]。课题组前期对药材基原考证、饮片炮制、剂量等进行了大量考证，最终确定了芍药甘草汤的处方量、加水量等关键工艺参数，为芍药甘草汤制备工艺研究提供了依据。通过对芍药甘草汤的药理作用、临床研究、质量控制等文献研究确定其主要活性成分，并建立相应的质量标准。目前对于芍药甘草汤的质量研究集中于指纹图谱的建立及有效成分的含量测定[5,6]。张保国等[7]研究发现芍药甘草汤具有抗炎、镇痛、解痉等药理作用，为芍药甘草汤指标成分的选择提供了理论依据。本研究以芍药甘草汤煎液出膏率，各指标成分的转移率等为指标对芍药甘草汤物质基准的制备进行工艺研究；并对芍药甘草汤中稳定且与功效相关的成分建立合理质量控制标准，建立相应的特征图谱用以控制不同批次冻干粉的稳定性，为芍药甘草汤的关键质量属性提供参考，为后续制剂制备工艺及质量控制等提供参考。1材料高效液相色谱仪，LC-，日本岛津公司。芍药苷对照品（-）、甘草对照品（-）、甘草酸铵对照品（-）购自于中国食品药品检定研究院。水为纯化水。芍药甘草汤饮片均购自于3个产地，产地信息见表1。白芍为毛蔑科植物芍药PaeonialactifloraPall．的干燥根，甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch．的干燥根和根茎。所用药材均经过济南市药品检验所宋希贵主任进行鉴定，均符合要求。芍药甘草汤所用饮片按照年版《中国药典》芍药及甘草项下含量测定方法进行检查，均符合要求。表批冻干粉中各饮片的产地信息2方法与结果2.1物质基准的制备芍药55g，炒甘草55g，置2L砂锅中，加水mL，盖盖，浸泡30min，用电陶炉作为热源，先武火（W）加热至沸，后文火（W）保持微沸煎至mL，趁热滤过（目），滤液减压浓缩（50℃，-0.1MPa）至50mL，预冻至结冰，冷冻干燥，研细，装袋，即得。2.2对照品溶液及供试样品的制备2.2.1对照品溶液制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液，即得。取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1mL分别含甘草苷20μg、甘草酸铵μg的溶液，即得（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.）。2.2.2煎液供试品溶液的制备精密量取芍药甘草汤煎液3mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，r/min离心5min，滤过，取续滤液，作为供试样品。2.2.3浓缩液试品溶液的制备精密量取煎煮液1.7mL，置50mL量瓶中，加70%甲醇约45mL，超声处理（功率W，频率40kHz)30min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得煎煮液供试品溶液。精密量取浓缩液0.2mL，置50mL量瓶中，加70%甲醇约45mL，超声处理（功率W，频率40kHz)30min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得浓缩液供试品溶液。2.2.4干燥粉末供试品溶液的制备取芍药甘草汤干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（mm×4.6mm,5μm）；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为nm。表2含量测定梯度洗脱测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。2.4煎煮工艺的研究2.4.1粉碎粒度的考察分别取芍药、炒甘草4目、10目粗颗粒及饮片，按比例称取置砂锅中，加水mL，盖盖，浸泡30min，然后置电陶炉上，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（目）。按上述供试样品方法制备样品进样，采用综合评分法对考察指标进行赋分，筛选芍药苷草汤煎煮最佳粒度[8]。计算公式为：综合得分=0.1×X1/X1max+0.1×X2/X2max+0.1×X3/X3max+0.1×Y/Ymax(X1～X3分别为芍药苷、甘草苷、甘草酸，Y为出膏率）。结果见表3，综合评分最高的为4目筛，故选择过4目筛的粗颗粒。表3饮片粒度考察结果2.4.2浸泡时间考察取4目粗颗粒2份，分别置2个2L砂锅中，加水mL，盖盖，分别不浸泡、浸泡30min，然后置电陶炉上加热，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（目）。按上述供试样品方法制备样品进样，通过综合评分法进行优选。实验结果见表4，综合评分最高的为浸泡30min，故在煎煮前需先浸泡30min。
表4浸泡时间考察结果2.4.3煎器考察取4目粗颗粒3份，分别置2L砂锅，2L不锈钢锅，2L烧杯中，加水mL，盖盖，分别浸泡30min，然后置电陶炉上加热，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（目）。按上述供试样品方法制备样品进样，通过综合评分法进行优选。结果见表5，综合评分最高为砂锅，且古代煎药多采用砂锅，现代煎药也首推砂锅，砂锅的化学性质稳定，受热均匀，能均衡而持久地把外界热能传递给内部原料，相对平衡的环境温度，有利于水分子与药物的相互渗透，适用于小火慢熬。故煎器选用砂锅最为合理[9,10]。表5煎器考察结果2.4.4加热方式考察取4目粗颗粒4份，分别4个置2L砂锅中，加水mL，盖盖，分别浸泡30min，然后分别置电陶炉、天然气炉，电阻炉，电磁炉上，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（目）。按上述供试样品方法制备样品进样，通过综合评分法进行优选。结果见表6，综合评分最高的为电陶炉。在现代煎煮过程中电陶炉的可控性、安全性更高，因此后续的试验将采用电陶炉[11]。表6加热方式考察结果2.4.5是否加盖考察[12]取4目粗颗粒2份，分别2个置2L砂锅中，加水mL，分别浸泡30min，然后置电陶炉，一份加盖煎煮，一份不加盖煎煮，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（目）。按上述供试样品方法制备样品进样，通过综合评分法进行优选。结果见表7，综合得分最高的是加盖煎煮。加盖更有利于保存气味，煎煮时长适当，出膏率更高，因此应当选择加盖煎煮。表7是否加盖考察结果2.4.6滤过工艺考察采用自然过滤，不加压。拟以滤液得膏率为指标，对比目筛网、目筛网、目筛网的滤过效果。取6份煎煮液，每2份分别趁热通过同规格滤材，测定滤液的得膏率结果见表8。从结果得知，不同目数的筛网，滤过速度和效果不同，目筛耗时最短，滤速最快，出膏率也最高，药物残渣滤过而影响煎液质量；目筛耗时最长，滤速最慢，出膏率相应最低，而且截留物增多。故选择目筛滤过。表8滤材考察2.5浓缩、冷冻干燥工艺2.5.1浓缩温度考察按优选工艺制备芍药甘草汤的物质基准，5份溶液。按照上述方法进行供试样品溶液的制备，按“2.3”项下色谱条件进行检测分析。结果见表9，由结果可知45～60℃均能实现浓缩，随着浓缩温度的提高，浓缩耗时逐渐减少；4个浓缩温度下所得浓缩液的颜色一致；3个指标成分的转移率，50℃均最高，其他温度稍低。综合考虑，最优浓缩温度为50℃。表9浓缩温度考察2.5.2干燥工艺考察按优选工艺制备芍药甘草汤的物质基准，2份溶液。浓缩至50mL，分别进行冷冻干燥、减压干燥。按照“2.2”项下干燥粉末供试样品的方法制备样品，按照“2.3”项下色谱条件进行检测分析。比较2种干燥方式对有效成分的保留情况，结果见表10。由数据可知，真空干燥干燥时间较冷冻干燥明显长，且真空干燥对有效成分的保留较差，故芍药甘草汤物质基准的干燥工艺优选为冷冻干燥。表10干燥工艺考察2.6芍药甘草汤物质基准的制备工艺在遵循古籍原文的基础上，通过综合评分优选芍药甘草汤的最佳煎煮工艺：芍药、炒甘草粉碎过4目筛，按比例称取置于2L砂锅中，加水mL，盖盖，浸泡30min，于电陶炉上加热，武火煎煮至沸腾，改用文火保持微沸，煎至mL，趁热滤过（过目筛）。滤液减压浓缩（50℃，-0.1MPa）至50mL，预冻至结冰，冷冻干燥，研细，装袋，即得。2.7多批次物质基准的制备及质量标准的建立采用随机数字法制备15批物质基准，通过有效成分的含量及特征图谱建立芍药甘草汤物质基准的质量标准。2.7.1指标成分的含量范围按“2.2”项下冻干粉方法制备供试样品，“2.3”项下色谱条件进行检测分析。所得含量以（1±30%）平均值为限度，建立芍药甘草汤各指标成分的限度范围，结果见表11。最终确定芍药甘草汤中芍药苷的质量分数范围为28.4～52.6mg/g，甘草苷的质量分数范围为7.7～14.1mg/g，甘草酸的质量分数范围为20.6～38.2mg/g。表11指标成分对比结果2.7.2多批物质基准的特征图谱(1）供试样品的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。(2）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，检测波长为nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于。梯度洗脱如下表12。表12梯度洗脱(3）特征图谱的建立：取15批冻干粉，制备供试样品，进样测定，记录色谱图，供试品色谱中应呈现9个与对照特征图谱相对应的色谱图；统计特征峰的保留时间及相对保留时间（见表13、表14），用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（）”将图谱叠放，见图1。图中S1～S15代表15批冻干粉，生成的对照特征图谱见图2。供试品特征图谱中应呈现9个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10%之内，保留时间规定值为：0.15（峰1）、0.20（峰2）、0.24（峰3）、0.27（峰4）、0.38（峰5）、0.57（峰6）、0.64（峰7）、0.82（峰8）、1.00[峰9(S）]。表批冻干粉特征图谱特征峰保留时间表批冻干粉特征图谱特征峰相对保留时间
图批冻干粉特征图谱
图2芍药甘草汤对照特征图
注：峰3：芍药苷；峰5：甘草苷；峰9：甘草酸。
3讨论
3.1加水量及剂量分析《伤寒论》有云：“芍药、甘草炙，各四两，上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分温再服。”解释了芍药甘草汤详细的煎煮方法。经考证汉代一两为13.75g，一升为mL[13,14]。3.2粒度分析芍药甘草汤出自汉代《伤寒论》，主要是受生产条件及社会发展情况的影响，所记载的饮片炮制主要为“咀”。部分医家从字面意思将其误解为“咀嚼”，从类人猿就懂得使用石块等工具破碎坚果来看，古人没有必要用口嚼来破碎药材。后经考证，“咀”是“父且”的通假字，应为切割之意，《医心方·卷第一》引葛洪《葛氏方》：“咀者，皆应细切。”切的过程中，会产生细粒，所以本实验考察4、10目的细粒煎煮情况[15,16]。3.3制备工艺分析“遵古”是经典名方研究开发遵循的主要原则，本实验前期经过严格详细的考证，确定了芍药甘草汤的剂量、加水量、炮制工艺等参数。并采用现代分析技术与传统药锅煎煮方式相结合的方式优选最佳煎煮工艺，确定了药材的粉碎粒度、煎煮容器、加热方式、浸泡时间等工艺参数，其中粉碎粒度、加热方式对成分的煎出率影响较大。浓缩参数选择的原则是最小程度破坏成分，且兼顾浓缩效率。减压浓缩具有温度低、效率高的特点，为制药工业普遍采用，本浓缩采用减压浓缩，不考虑常压浓缩。冷冻干燥是在低温、低压下进行，与其他干燥方法相比，物料的物理结构和分子结构变化极小，其组织结构和外观形态被较好地保存，而且能有效抑制热敏性物质发生生物、化学或物理变化，较好地保存了活性物质。使干燥物质最大程度保持同煎煮液的质量一致性。3.4含量测定结果及特征图谱分析含量测定是从个别指标上对冻干粉进行质量控制，而特征图谱的建立，对于从整体上对冻干粉进行质量控制有重要意义。本研究对15批芍药甘草汤的物质基准进行特征图谱分析，标定了其中3个峰，并通过含量测定对标定的3种成分进行含量测定，所用方法具有合理性、可行性、稳定性，能够较好地反映芍药甘草汤冻干粉的物质群及质量，为芍药甘草汤制剂研究奠定了基础。END联盟服务内容包括但不限于：
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